體外轉(zhuǎn)錄獲得的mRNA未經(jīng)細(xì)胞內(nèi)一系列修飾，不具備Cap 結(jié)構(gòu)與PolyA 尾，容易降解，易激活免疫反應(yīng)，不能與核糖體起始蛋白結(jié)合，無法啟動蛋白翻譯，因而在工業(yè)化mRNA生產(chǎn)中，需使用牛痘病毒加帽酶對IVT 的mRNA進(jìn)行加帽修飾，使mRNA的5' 端獲得Cap0 結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步使用2'-O- 甲基轉(zhuǎn)移酶將Cap0 轉(zhuǎn)化為Cap1。酶法加帽引入的帽結(jié)構(gòu)與真核生物體內(nèi)天然帽結(jié)構(gòu)*一致，從根本上降低外源mRNA 免疫原性的同時，保護(hù)其不被降解，并提高翻譯效率，增加細(xì)胞內(nèi)蛋白產(chǎn)量。通過酶法加帽最大可獲得100%的加帽效率，而通過化學(xué)合成帽類似物結(jié)構(gòu)加帽，其加帽效率相對較低，并且帽類似物結(jié)構(gòu)與天然帽結(jié)構(gòu)有差異。

mRNA Cap 2′-O-Methyltransferas 可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體， 在 RNA 5′末端緊鄰帽結(jié)構(gòu)（Cap 0）的第一個核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團(tuán)，形成帶有 Cap 1 結(jié)構(gòu)的 mRNA。Cap1 結(jié)構(gòu)能增強 mRNA 的翻譯效率，從而可提高轉(zhuǎn)染后 mRNA 編碼的蛋白表達(dá)水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 為底物，不會作用于 5′末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 可通過 Vaccinia Capping System來制備。 

本制品利用大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)，采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，并嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留等，符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。

1. ISO 9001:2015, certified facility。
2.《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》國家藥品監(jiān)督管理局。
3.《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。
4. USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細(xì)胞治療，基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。
5. USP Chapter <92>, Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中細(xì)胞因子和生長因子。
6. Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生產(chǎn)細(xì)胞或基因治療藥物的生物來源原料。

Cap0 結(jié)構(gòu)的 mRNA 2′-O 甲基化（Cap1），以提高 mRNA 的翻譯和表達(dá)效率。

1. 用于反應(yīng)的 RNA 在使用之前應(yīng)進(jìn)行純化并溶解于 RNase-free water。溶液中不能含有 EDTA 和鹽；
2. 在配置反應(yīng)體系時，建議使用 RNase 抑制劑以增強反應(yīng)中 RNA 的穩(wěn)定性?？梢约尤?0.5µl 的 RNase 抑制劑，同時去掉等體積的 RNase-free water；
3. 反應(yīng)之前加熱 RNA 可以去除 5′端的二級結(jié)構(gòu)。如果轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 5′端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可以把加熱時間延長至 10 分鐘；
4. SAM 在 pH 7–8, 37°C 條件下不穩(wěn)定，需要在反應(yīng)開始之前新鮮配置?？墒孪扔嬎愫?SAM 的用量，在反應(yīng)開始前將 32 mM的儲備液稀釋成 4 mM 的工作液。為避免 SAM 降解，該工作液需要保存于冰上。