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小分子越來越難做，大分子發(fā)展很強(qiáng)勢，似乎成為了近年來藥物研發(fā)市場的重要表現(xiàn)之一，“多肽"類藥物正是其中的一大熱門。目前多肽藥物的質(zhì)量監(jiān)管日趨漸嚴(yán)，在這種趨勢下，尋找能滿足更高分離度，靈敏度的分析方法就顯得尤為重要。很多小伙伴在在開發(fā)多肽類樣品分析方法中總是遇到各種的問題，無比煩惱。這里就總結(jié)了一些在多肽方法開發(fā)中常見的問題分享給各位小伙伴。

1、多肽含量與多肽純度有什么區(qū)別？

一條多肽產(chǎn)品中除了多肽本身還包括生產(chǎn)過程中帶入的水份及有機(jī)鹽分等雜質(zhì)，多肽純度僅指多肽本身所含肽產(chǎn)品的含量及雜質(zhì)的含量，不包括水份等雜質(zhì)；而多肽含量則是指目標(biāo)多肽在產(chǎn)品中的凈含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法來檢測；因此一條多肽即使純度達(dá)到99%，因?yàn)楫a(chǎn)品中還包含水份及有機(jī)鹽分等，它的含量可能也只有70-80%。

2、如何溶解多肽？

多數(shù)多肽都可以用超純水溶解，對(duì)于一些難溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，對(duì)于酸性多肽，可先以小量堿性（如0.1%氨/水）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于堿性多肽，可先以小量酸性（如醋酸，三fu乙酸）溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于疏水性多肽，可用有機(jī)溶劑溶解，如DMF，甲醇，丙醇，異丙醇，DMSO等。

3、為什么流動(dòng)相中要加入三fu乙酸作為離子對(duì)試劑，還有哪些流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑可用于多肽的分離純化？

加入三fu乙酸能調(diào)節(jié)洗脫液的PH，同時(shí)作為離子對(duì)試劑與多肽相互作用，從而增強(qiáng)分離效果，明顯改善峰形。

其它可用于多肽分離純化的流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑包括醋酸體系，磷酸體系，鹽酸體系，七氟丁/酸等通過適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)PH都能取得很好的分離效果。

另外三fu乙酸優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去，另一方面，三fu乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm，對(duì)多肽在低波長處的檢測干擾很小。

4、檢驗(yàn)多肽的色譜柱出現(xiàn)柱壓升高，柱效下降該如何解決？

日常對(duì)色譜柱沖洗維護(hù)可以遵循色譜柱出廠說明書，但是在分析多肽等蛋白質(zhì)樣品時(shí)還容易出現(xiàn)一種現(xiàn)象：蛋白污染。主要是柱頭端填料出現(xiàn)結(jié)塊，如果出現(xiàn)蛋白污染，建議使用yi腈-水-三fu乙酸 = 50-50-0.1小流速反向沖洗60倍柱體積或者反向沖洗過夜。

5、多肽樣品在新的硅膠基質(zhì)色譜柱上不出峰或者峰面積異常小，這是為什么？

這是因?yàn)槿嗫浊蛐喂枘z柱上的非特異吸附位點(diǎn)對(duì)多肽產(chǎn)生死吸附從而導(dǎo)致不出峰。

色譜柱中非特異性吸附位點(diǎn)主要來源于殘留的硅醇基、硅膠中的殘留重金屬、鍵合相脫落后暴露的硅羥基，柱管內(nèi)壁沒有被鈍化的位點(diǎn)。這些都會(huì)對(duì)多肽樣品有較強(qiáng)的非特異性吸附。

其實(shí)在開始使用新色譜柱時(shí)，對(duì)生物樣品這樣的非特異性吸附會(huì)比較嚴(yán)重，可以對(duì)色譜柱進(jìn)行高濃度樣品飽和處理。在正式檢測前預(yù)先進(jìn)樣，使樣品在柱子上累積，覆蓋住這樣的位點(diǎn)，才會(huì)使我們以后的分析有好的色譜圖。建議隔一分鐘進(jìn)一次樣，連續(xù)進(jìn)十幾針，用過量樣品覆蓋掉非特異性吸附位點(diǎn)。等峰面積，峰形穩(wěn)定后就可以正式檢測樣品。

6、TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)PH的作用？TFA的濃度越高基線漂移越厲害，那是不是說TFA的濃度在緩沖液PH允許的情況下越低越好？

（1）TFA起到類似離子對(duì)的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過高的濃度，會(huì)使溶液偏酸，長時(shí)間使用可能影響柱子壽命。

（2）同時(shí)TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時(shí)0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱。

7、在多肽檢測過程中經(jīng)常出現(xiàn)基線漂移的原因是什么？怎么解決？

固定三fu乙酸濃度的梯度洗脫有時(shí)會(huì)在210-220nm檢測處造成吸收基線的漂移，這是許多反相分離中基線漂移的原因。

降低或消除由于三fu乙酸光譜吸收變化引起的基線漂移需要盡量使檢測波長靠近215nm，并在溶劑B中比在溶劑A中少加15%的三fu乙酸補(bǔ)償基線漂移。例如溶劑A中的三fu乙酸為0.1%時(shí)，溶劑B中可用0.085%。

8、如何選擇純化過程中使用的色譜柱填料？

不同序列的多肽理化性質(zhì)及疏水性有很大的區(qū)別，多數(shù)情況分子量小于4000和親水性多肽用Ｃ18柱分離效果z佳，分子量大于5000和j端疏水性的多肽以Ｃ4柱分離效果z佳，而Ｃ8柱介于Ｃ18和Ｃ4柱之間，其應(yīng)用效果與Ｃ18柱更相似；對(duì)一些特殊選擇性的多肽，也可選擇苯基柱。